Das Thema „Nacht“ wird in drei Themenkreisen behandelt, die weit in die Philosophie, Psychologie und Astronomie reichen: Der erste behandelt die Zeit um 1800 mit ihrer Opposition zwischen dem naturverbundenen Ansatz der Romantiker und der wissenschaftlichen Sicht der Aufklärung. Der zweite umfasst den Höhepunkt positivistischer Wissenschaftlichkeit um 1900, die parallel zur Elektrifizierung der Städte entsteht. Als zeitgenössischer und dritter Aspekt werden u.a. natürliche und künstliche Unterwelten thematisiert – Höhlen, Grotten, Bergwerke, U-Bahnen, Theater, Kinos und Bars.
Neben Hauptwerken der Malerei von Caspar David Friedrich, Ernst Ludwig Kirchner, Emil Nolde, Anselm Kiefer oder Gerhard Richter sollen auch nächtliche Allegorien wie die „Königin der Nacht“ in Mozarts „Zauberflöte“ nicht zu kurz kommen. Berühmte Fotografen wie Ansel Adams, Edvard Steichen und Jeff Wall werden in Bezug zur Malerei gesetzt. Dazu kommen Skulpturen, Objekte und Filme sowie frühe wissenschaftliche Aufnahmen, auch vom Weltraum.